Generazione di un parassita mutatore per guidare la scoperta del resistoma nel Plasmodium falciparum

Nature Communications volume 14, numero articolo: 3059 (2023) Citare questo articolo

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L’evoluzione in vitro della resistenza ai farmaci è un approccio potente per identificare i bersagli antimalarici, tuttavia, gli ostacoli principali allo sviluppo della resistenza sono la dimensione dell’inoculo del parassita e il tasso di mutazione. Qui abbiamo cercato di aumentare la diversità genetica dei parassiti per potenziare le selezioni di resistenza modificando i residui catalitici della DNA polimerasi δ del Plasmodium falciparum. I test di accumulo di mutazioni rivelano un aumento di circa 5–8 volte nel tasso di mutazione, con un aumento di 13–28 volte nelle linee sottoposte a pressione del farmaco. Dopo l'esposizione allo spiroindolone PfATP4-inibitore KAE609, si ottiene una resistenza di alto livello più rapidamente e con un numero di inoculi inferiore rispetto ai parassiti selvatici. Le selezioni producono anche mutanti resistenti a un composto "irresistibile", MMV665794, che non è riuscito a produrre resistenza con altri ceppi. Convalidiamo le mutazioni in un gene precedentemente non caratterizzato, PF3D7_1359900, che chiamiamo proteina di resistenza alla chinossalina (QRP1), come causale della resistenza a MMV665794 e a un pannello di analoghi della chinossalina. L'aumento del repertorio genetico disponibile per questo parassita "mutatore" può essere sfruttato per guidare la scoperta del resistoma di P. falciparum.

La scoperta di farmaci antimalarici è stata attivamente alla ricerca di farmaci nuovi o migliorati per trattare e infine eliminare la malaria. Le attuali terapie combinate di prima linea (ACT) a base di artemisinina per il Plasmodium falciparum sono state compromesse dall'emergere di parassiti meno sensibili sia all'artemisinina che ai farmaci associati nel sud-est asiatico, un epicentro della resistenza antimalarica1,2. Inoltre, la resistenza all’artemisinina rappresenta una minaccia per la salute pubblica per le persone che vivono in regioni endemiche in tutto il mondo, come esemplificato da recenti rapporti sull’emergenza di mutazioni kelch13 in isolati ruandesi e ugandesi che causano una ridotta suscettibilità all’artemisinina3,4. Molti composti antimalarici promettenti con buona potenza e attività a più stadi sono stati scoperti utilizzando lo screening basato sul fenotipo della cellula intera5. Tuttavia, questo approccio presenta difficoltà per l'ottimizzazione del lead a causa della mancanza di conoscenza del bersaglio molecolare. Una comprensione più approfondita del bersaglio del farmaco, della modalità d’azione e del meccanismo di resistenza potrebbe portare alla progettazione di farmaci migliori in grado di resistere alla resistenza ai farmaci6,7,8. Inoltre, la conoscenza del bersaglio del farmaco o del gene di resistenza fornisce marcatori molecolari per la sorveglianza epidemiologica genomica sul campo per monitorare la diffusione e il contenimento della resistenza ai farmaci9,10.

L'evoluzione in vitro della resistenza ai farmaci seguita dall'analisi dell'intero genoma è diventata un approccio chiave per l'identificazione del bersaglio dei farmaci poiché aiuta a definire le modalità di azione, nonché i meccanismi e le propensioni per la resistenza11,12,13. Una tipica selezione della resistenza in vitro viene eseguita utilizzando inoculi di parassiti che vanno da 105 a 109 parassiti, che vengono esposti a un composto antimalarico ad una concentrazione in grado di uccidere tutti i parassiti sensibili ai farmaci8,14,15. I parassiti recrudecenti possono quindi essere sottoposti al sequenziamento dell'intero genoma per identificare il gene sottostante responsabile del fenotipo di resistenza. Il principale ostacolo al successo è il prolungamento o in alcuni casi la completa incapacità di selezionare parassiti resistenti, indipendentemente dal regime di selezione o dal ceppo di fondo. Questo processo ad alta intensità di lavoro e tempo potrebbe quindi non riuscire a identificare un bersaglio molecolare o un meccanismo d'azione definito per i composti interrogati. Ad esempio, in una serie di selezioni di resistenza in vitro con 48 composti effettuate dal Malaria Drug Accelerator Consortium (MalDA), 23 composti hanno prodotto parassiti resistenti con resistenza osservata dopo 15-300 giorni16. I composti che non riescono a produrre parassiti resistenti dopo molteplici tentativi e condizioni sono stati definiti "irresistibili"17. Sebbene possano esserci molteplici possibili ragioni per cui i composti sono apparentemente “irresistibili”, la loro bassa propensione alla resistenza è una qualità interessante dal punto di vista della scoperta di farmaci antimalarici e quindi approfondimenti sul loro meccanismo d’azione sarebbero preziosi.