Rivelazione dei proteoformi del Corynebacterium glutamicum attraverso la parte superiore

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 2602 (2023) Citare questo articolo

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Il Corynebacterium glutamicum è un batterio ampiamente utilizzato nella produzione industriale di aminoacidi e di un'ampia gamma di altri prodotti biotecnologici. Il presente studio descrive la caratterizzazione delle proteoforme di C. glutamicum e delle loro modifiche post-traduzionali (PTM) utilizzando la proteomica top-down. Nonostante precedenti prove che i PTM abbiano un ruolo nella regolazione del metabolismo di C. glutamicum, questa è la prima analisi top-down del proteoma di questo organismo. Abbiamo identificato 1125 proteoforme da 273 proteine, con il 60% delle proteine ​​che presentano almeno uno spostamento di massa, suggerendo la presenza di PTM, tra cui diverse proteoforme acetilate, ossidate e formilate. Inoltre, sono state identificate proteine ​​rilevanti per la produzione di aminoacidi, la secrezione proteica e lo stress ossidativo con spostamenti di massa che suggeriscono la presenza di PTM e proteoforme non caratterizzate che possono influenzare i processi biotecnologicamente rilevanti in questo cavallo di battaglia industriale. Ad esempio, le proteine ​​di membrana mepB e SecG sono state identificate rispettivamente come proteoforma scissa e formilata. Mentre si trovava nel metabolismo centrale, OdhI è stato identificato come due proteoforme con potenziale rilevanza biologica: una proteoforma scissa e una proteoforma con PTM corrispondenti a uno spostamento di massa di 70 Da.

Il batterio Corynebacterium glutamicum è un cavallo di battaglia industriale in grado di produrre un'ampia gamma di biomolecole da un ampio pool di substrati1 ed è attualmente la migliore opzione per la produzione di aminoacidi L-alfa2. La produzione di aminoacidi rappresenta un mercato multimiliardario3, con una produzione annua di circa 10 milioni di tonnellate in tutto il mondo2, con l-glutammato e l-lisina corrispondenti rispettivamente a 3,3 milioni di tonnellate/anno e 2,2 milioni di tonnellate/anno2. Oltre alla produzione di aminoacidi, C. glutamicum viene utilizzato anche in altri processi biotecnologici, come la produzione di proteine ​​eterologhe4, acidi organici5, carotenoidi, isobutanolo6, polimeri7 e, più recentemente, è stato studiato il suo potenziale nei processi di biorisanamento8.

Recenti sviluppi nel campo della proteomica hanno dimostrato l'importanza delle modifiche post-traduzionali (PTM) in diverse specie di batteri9. In C. glutamicum, l'importanza dei PTM è stata studiata in precedenza rivelando l'effetto cruciale della fosforilazione dell'inibitore dell'ossoglutarato deidrogenasi (OdhI) nella produzione di l-glutammato10,11. Più recentemente, la proteomica della spettrometria di massa di C. glutamicum ha mostrato l'influenza delle condizioni di produzione di l-glutammato sulla succinilazione e acetilazione delle proteine ​​metaboliche di C. glutamicum, incluso OdhI12.

Attualmente esistono due principali approcci proteomici denominati bottom-up e top-down. In breve, nell'approccio bottom-up le proteine ​​vengono scisse da una proteasi (solitamente la tripsina) e i successivi peptidi vengono analizzati mediante spettrometria di massa, mentre nella procedura top-down le proteine ​​vengono esaminate nella loro forma intatta13. Come conseguenza della digestione delle proteasi, le informazioni provenienti da diverse regioni proteiche possono andare perse negli approcci dal basso verso l'alto, compresi i PTM. Inoltre, in questo approccio l'identità della proteina viene dedotta in base all'identificazione del peptide e ciò può causare ambiguità nei casi in cui i peptidi possono appartenere a più di una proteina13. Al contrario, l'approccio top-down consente l'identificazione dell'intera sequenza delle proteine. Inoltre, l'analisi delle forme intatte delle proteine ​​consente l'identificazione delle proteoforme, definite come diverse forme di proteine ​​derivate dallo stesso gene14. Tali proteoforme possono essere generate mediante sostituzione di residui amminoacidici, scissione proteolitica, splicing alternativo e diversi tipi di PTM15. Inoltre, diverse proteoforme della stessa proteina possono avere funzioni diverse e influenzare i processi biologici di un organismo16. Il potere della proteomica top-down è stato applicato ad altri batteri17. Ad esempio, è stata eseguita la proteomica top-down dell'Escherichia coli e l'identificazione delle proteoforme18. Nonostante l’evidenza della rilevanza dei PTM nel metabolismo di C. glutamicum, fino ad oggi non sono stati pubblicati studi proteomici top-down. Qui abbiamo effettuato la prima analisi proteomica top-down di C. glutamicum, utilizzando un approccio tollerante ai precursori per identificare e rivelare PTM e proteoforme.