Profilazione dell'ambiente intestinale umano in condizioni fisiologiche

Natura volume 617, pagine 581–591 (2023) Citare questo articolo

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La struttura spaziotemporale del microbioma1,2, del proteoma3 e del metaboloma4,5 umani riflette e determina la fisiologia intestinale regionale e può avere implicazioni per la malattia6. Tuttavia, si sa poco sulla distribuzione dei microrganismi, sul loro ambiente e sulla loro attività biochimica nell’intestino a causa della dipendenza dai campioni di feci e dell’accesso limitato solo ad alcune regioni dell’intestino mediante endoscopia in individui a digiuno o sedati7. Per risolvere queste carenze, abbiamo sviluppato un dispositivo ingeribile che raccoglie campioni da più regioni del tratto intestinale umano durante la normale digestione. La raccolta di 240 campioni intestinali da 15 individui sani utilizzando il dispositivo e le successive analisi multi-omiche hanno identificato differenze significative tra batteri, fagi, proteine ospiti e metaboliti nell'intestino rispetto alle feci. Alcuni taxa microbici erano arricchiti in modo differenziale e l’induzione del profago era più prevalente nell’intestino che nelle feci. Il proteoma dell'ospite e i profili degli acidi biliari variavano lungo l'intestino ed erano altamente distinti da quelli delle feci. Le correlazioni tra i gradienti nelle concentrazioni di acidi biliari e l'abbondanza microbica prevedevano specie che alteravano il pool di acidi biliari attraverso la deconiugazione. Inoltre, le concentrazioni di acidi biliari microbicamente coniugati mostravano tendenze aminoacidi-dipendenti che non erano evidenti nelle feci. Nel complesso, la profilazione longitudinale non invasiva di microrganismi, proteine e acidi biliari lungo il tratto intestinale in condizioni fisiologiche può aiutare a chiarire i ruoli del microbioma e del metaboloma intestinale nella fisiologia e nella malattia umana.

Il tratto intestinale umano ospita la stragrande maggioranza dei microrganismi che risiedono nel o sul nostro corpo1; il loro contenuto genetico e le capacità di trasformazione biochimica sono centinaia di volte più grandi di quelli codificati dal genoma umano8. Gli esseri umani dipendono dai microrganismi intestinali per la digestione del cibo, la regolazione del sistema immunitario e la protezione contro gli agenti patogeni, tra le altre funzioni critiche1. Un aspetto importante ma spesso trascurato dell’intestino è l’eterogeneità regionale e il suo impatto sulla fisiologia locale9. A causa delle difficoltà di accesso e campionamento del tratto intestinale, le feci sono state la principale fonte di informazioni per gli studi sul microbioma intestinale umano10. Tuttavia, le feci riflettono i prodotti di scarto e gli effluenti a valle, all'interno dei quali si perde la variazione regionale. Ad esempio, i metaboliti chiave come gli acidi biliari vengono alterati a monte dalle trasformazioni microbiche e quindi sostanzialmente assorbiti dall'ospite prima dell'escrezione4. Le regioni dell'intestino distali allo stomaco (duodeno, digiuno, ileo e colon) differiscono notevolmente in termini di disponibilità di nutrienti, pH, pressione parziale di ossigeno, struttura della mucosa e velocità di flusso7. Di conseguenza, in ciascuna regione intestinale sono presenti comunità microbiche distinte con funzioni specializzate, metabolomi, nicchie immunitarie e proteomi3,4,11. Pertanto, una comprensione più approfondita di come i microrganismi intestinali influiscono sulla fisiologia umana e viceversa richiede il campionamento locale del microbioma intestinale e del suo ambiente chimico in stati naturali e imperturbati.

Storicamente, campionare il tratto intestinale umano senza disturbi o contaminazioni è stato impegnativo10. Recentemente abbiamo scoperto una sostanziale variabilità regionale nella composizione del microbiota su scale spaziali di soli pochi centimetri nell’intestino di donatori di organi deceduti2. Tuttavia, i donatori di organi sono stati generalmente trattati con antibiotici e, anche nei casi in cui il tratto intestinale è stato prelevato immediatamente dopo la cessazione del supporto vitale, l'intestino è spesso ischemico o necrotico. Il campionamento duodenale da individui vivi mediante endoscopia superiore ha un'alta probabilità di contaminazione involontaria da contenuto orale, esofageo o gastrico. L'accesso endoscopico al medio digiuno richiede una procedura di circa 2 ore che prevede l'anestesia generale o la sedazione, eseguita a digiuno12,13. In alternativa, una stomia derivante dall'esteriorizzazione dell'ileo attraverso la parete addominale può fornire campioni intestinali, ma questa procedura è invasiva e riflette l'anatomia e la fisiologia dell'intestino alterate, in un'unica posizione14. Nonostante gli importanti effetti sul microbioma e le proprietà di segnalazione degli acidi biliari, gli studi sulla loro diversità chimica e sulle concentrazioni si sono basati su misurazioni non rappresentative della piccola percentuale di acidi biliari nelle feci o di una frazione di percentuale nel sangue. I dispositivi ingeribili sviluppati in precedenza per il campionamento del tratto intestinale umano presentano importanti limitazioni come l'elettronica complessa15, le grandi dimensioni che rischiano di trattenere il dispositivo15 o il volume di campionamento insufficiente per analisi multi-omiche16. I profili di pH, la peristalsi, la dieta, la fisiologia, i disturbi gastrointestinali e i metaboliti chiave come gli acidi biliari17 differiscono notevolmente tra uomo e animale18, rendendo gli studi sull’uomo più rilevanti per la fisiologia e le malattie umane.

0.75 between devices and stool that were significantly differentially abundant (n = 28 ASVs across n = 268 analysed samples; limma-voom was used to calculate differential expression after size factors were estimated and normalized using DESeq2; P < 0.05, Benjamini–Hochberg correction)./p> 0.75) in intestinal samples than in stool (Fig. 1f). The Romboutsia genus was recently named following isolation of a species from rat ileal digesta26, in line with this genus having a niche in the small intestine./p>40% (Fig. 2c). Consequently, individual intestinal samples contained communities with lower alpha diversity relative to the intra-individual diversity represented by all samples from a device of a certain type or by all samples from devices swallowed at the same time (Fig. 2d and Extended Data Fig. 3b,c). Thus, much of the higher variability across intestinal samples relative to stool is probably due to the dynamic and heterogeneous nature of the microbiota along the intestinal tract./p>75% complete and <25% contamination) from these data (Methods and Supplementary Table 3), which enabled taxonomic identification for read-mapping applications. On the basis of the established role of the gut microbiota in carbohydrate degradation and its links to health and disease27, we first focused on carbohydrate active enzyme (CAZyme) gene abundance in each region. The percentage of reads that mapped to CAZymes in devices exhibited greater variance than in stool (Extended Data Fig. 5a,b). Within devices, CAZyme gene abundance was positively correlated with the relative abundance of five ASVs: two unnamed Bacteroides species, two Bacteroides vulgatus strains and Parabacteroides merdae (P < 0.001, Benjamini–Hochberg corrected; Extended Data Fig. 5c). The B. vulgatus strains exhibited the highest slope and strongest correlation (Spearman's ρ = 0.77 and 0.75). By contrast, in stool, despite a correlation between the abundance of CAZyme genes and the Bacteroidaceae family (Extended Data Fig. 5d), there were no ASVs whose abundance correlated with CAZyme gene abundance, probably because of the greater evenness of the taxa observed in stool compared with intestinal samples (Fig. 2c)./p>95%; Supplementary Table 2) from this library showed that the 35 members of the Bacteroidetes phylum typically contained more CAZyme genes than members of other phyla (Extended Data Fig. 5e). The dataset included ten Parabacteroides strains (eight Parabacteroides distasonis and two P. merdae). Each CAZyme gene was annotated with a CAZyme enzyme class and family to give a putative functional category. The CAZymes detected in the P. merdae strains were assigned to a mean of 107.5 unique CAZyme functional categories out of a mean of 237.5 CAZymes, and P. distasonis enzymes were assigned to 95 unique CAZyme functional categories out of a mean of 237.5 CAZymes; thus, P. distasonis strains appear to contain greater redundancy than P. merdae strains (Supplementary Table 4). Furthermore, P. merdae strains contained seven additional unique CAZyme functional categories in the glycoside hydrolase family and five additional unique polysaccharide lyase functional categories compared with P. distasonis strains (Supplementary Table 4). We also investigated five strains of B. vulgatus: each possessed 301 or 302 CAZyme genes representing 131 unique functional categories, more than in any other non-Bacteroides isolate (Extended Data Fig. 5e and Supplementary Table 4). However, B. vulgatus was the Bacteroides species with the fewest CAZyme genes (Extended Data Fig. 5e and Supplementary Table 4), indicating that factors other than CAZyme abundance influence the dominance of B. vulgatus over other Bacteroides species in the intestines. These differences in CAZyme gene abundance and functional categories are an important consideration for how diet drives the growth of certain bacteria in the gastrointestinal tract and for which by-products of carbohydrate degradation may be available to the host./p>50% completeness, of which 629 were integrated prophages (Methods). Of these vOTUs, 83% (1,343/1,607) were present in both stool and intestinal samples (Fig. 3a), indicating that the intestines and stool have similar viromes. The abundance of these vOTUs as determined by read mapping was generally correlated between intestinal and stool samples (Extended Data Fig. 6a), although the intestinal samples had higher viral read mapping fractions (Extended Data Fig. 6b), perhaps owing to lower bacterial densities1. Viromes were more similar between stool and intestinal samples from the same participant (Jaccard distance of 0.40 ± 0.14, mean ± s.d.) than between stool (0.58 ± 0.09) or intestinal (0.62 ± 0.10) samples from different participants (P < 10−10 in both cases, two-tailed Student's t-test), and PCoA of the viromes (Fig. 3b) showed similar clustering as with the microbiota (Fig. 1e)./p> 1 and P < 0.05 are coloured on the basis of sample type and enrichment. c, PCA of normalized human protein abundance shows separation between intestinal and stool samples (n = 212 and 56, respectively). d, Human proteome composition varies significantly more between intestinal samples (n = 212) than between stool samples (n = 56), both within (top) and across (bottom) participants. Top, each circle is the median Pearson correlation coefficient of all sample pairs for a given participant. Bottom, each circle is the median of all correlation coefficients between all pairs of samples from any two participants (n = 105 for each intestinal and stool sample). ****P ≤ 0.0001, Bonferroni-corrected two-tailed Wilcoxon rank-sum test. e, PCA from c highlighting the clustering of intestinal and stool samples from participant 15 (n = 15 and 4, respectively). f, Canberra distance between microbiota compositions was higher in samples with less similar human proteomes for all sample pairs of a given type (n = 20,706 pairwise comparisons for devices, n = 1,485 pairwise comparisons for stool)./p>90% and contamination of <10%, dereplicated to 99% average nucleotide identity (ANI)) and searched for the canonical BSH gene in each using a hidden Markov model. We found putative BSH genes in A. hadrus (7 of 8 MAGs) and A. putredinis (4 of 4 MAGs), in accordance with previous literature38. By contrast, none of the 12 F. prausnitzii MAGs nor the 3 B. wadsworthia MAGs contained any putative BSH genes, suggesting that these taxa may use glycine and taurine25 generated by other microbial deconjugation reactions./p>50 µl of intestinal fluids and were subjected to DNA extraction and 16S rRNA gene and metagenomic sequencing; the remainder sampled <50 µl or were filled with gas, most likely from the colon./p>50 µl, DNA was extracted using a Microbial DNA extraction kit (Qiagen)43 and 50 µl from a device, 200 µl of saliva or 100 mg of stool./p>2,500 reads were retained for analyses. We obtained sufficient sequencing reads from 210 samples, which were the focus of subsequent analyses, along with sequencing data from 29 saliva and 58 stool samples (one participant provided only one saliva sample, and one stool sample had insufficient sequencing reads; Extended Data Fig. 2a)./p>75% completeness and <25% contamination were dereplicated at 99% ANI (strain level) with dRep (v.3.0.0)58, resulting in 696 representative MAGs across all samples. GTDB-Tk was used to assign taxonomy59. Default parameters were used for all computational tools./p>90% coverage and dereplicated to create a curated database of AMR genes. Metagenomic reads for each sample were mapped against this database to calculate the percentage of reads mapped./p>1 kb in length were analysed using VirSorter2 (ref. 65), DeepVirFinder66 and VIBRANT67. Contigs identified as viral by at least one algorithm (VirSorter2 score ≥0.9, or DeepVirFinder score ≥0.9 and P < 0.05, or VIBRANT score of medium quality or higher) were clustered using an ANI cut-off of 0.95 and coverage cut-off of 85%. The quality of the clustered contigs was analysed using CheckV68, which also classified viral contigs as prophages if they contained both viral and bacterial regions./p>2 and the prophage region has >50% coverage./p> 0.995 for all bile acids), and the model was applied to all samples and blanks to calculate concentrations. The average concentration reported for method blanks was subtracted from sample concentrations. Because multiple dilutions were analysed for each sample, the measurement closest to the centre of the standard curve (750 ng ml–1) was used. Zero values were imputed with a concentration value between 0.001 and 0.1 ng ml–1. Concentrations were reported as ng ml–1 for intestinal sample liquid supernatant and ng g–1 for wet stool. In all, 218 device samples and 57 stool samples passed quality control and were used for analyses (Extended Data Fig. 2a)./p>