Regolazione reversibile delle attività di Cas12a da parte di AcrVA5

Cell Discovery volume 8, numero articolo: 45 (2022) Citare questo articolo

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Caro editore,

Il sistema clusterizzato di ripetizioni palindromiche brevi interspaziate regolarmente (CRISPR)/associato a CRISPR (Cas) protegge i batteri e gli archei dagli elementi genetici mobili (MGE) come i batteriofagi1. L'effettore Cas può essere guidato da un CRISPR RNA (crRNA) per colpire gli acidi nucleici invasori mediante accoppiamento di basi e quindi scindere il bersaglio per fornire immunità all'ospite2,3. Per far fronte alla pressione immunitaria imposta dal sistema CRISPR dell'ospite, i fagi hanno sviluppato diversi tipi di sistemi anti-CRISPR (Acr) per inattivare le nucleasi Cas e chiudere a loro volta il sistema immunitario dell'ospite4. Le proteine ​​Acr possono interagire direttamente con le proteine ​​Cas per impedire il caricamento del crRNA o il legame del target; in alternativa, possiedono attività enzimatiche per scindere i crRNA o modificare post-traduzionalmente le proteine ​​Cas4. Tra questi, esiste un'acetiltransferasi della famiglia GNAT recentemente segnalata, vale a dire AcrVA5, che è codificata dagli MGE e inibisce specificamente l'effettore di tipo VA Cas12a attraverso la modificazione dell'acetile di un sito chiave della lisina. Il Cas12a inattivato da AcrVA5 perde la capacità di interagire con il sito del motivo adiacente al protospacer (PAM) e non riesce a proteggere gli ospiti fendendo gli MGE invasori5,6. Attraverso l’inattivazione del sistema Cas12a, le MGE contenenti il ​​gene acrVA5 possono effettivamente disattivare il sistema immunitario batterico e avere il potenziale per diffondersi ampiamente tra gli ospiti che ospitano Cas12a. Tuttavia, con nostra grande sorpresa, il gene acrVA5 esiste solo in tre ceppi di Moraxella bovoculi che hanno perso le loro deacetilasi (Tabella Supplementare S1). Pertanto, è ragionevole sospettare che possa esistere una relazione competitiva tra l'acetiltransferasi AcrVA5 e le deacetilasi7 batteriche ampiamente distribuite, che possono riattivare Cas12a mediante deacetilazione per proteggere gli ospiti dall'invasione di MGE che ospitano la cassetta acrVA5.

Abbiamo eseguito per la prima volta l'esperimento di acetilazione in vitro mediato da AcrVA5 e abbiamo dimostrato che il batterio Lachnospiraceae (Lb) Cas12a acetilato da AcrVA5 ha perso sia le attività di scissione cis che trans verso il DNA bersaglio a doppio filamento (dsDNA) (Figura complementare S1a, b) , che era coerente con i risultati precedenti5,6, tuttavia, il trattamento con AcrVA5 non ha mostrato alcun effetto sulle attività di trans-scissione di LbCas12a quando attivato dal DNA bersaglio a filamento singolo (ssDNA) (Figura complementare S1c). Poiché il sito PAM è necessario solo affinché Cas12a riconosca il dsDNA target ma non il ssDNA8, i risultati di cui sopra hanno ulteriormente confermato che l'acetilazione mediata da AcrVA5 ha impedito a Cas12a di interagire con le sequenze PAM nel dsDNA5 target.

Oltre a LbCas12a, abbiamo analizzato anche gli ortologi Cas12a di Francisella tularensis subsp. novicida (FnCas12a) e Acidaminococcus sp. (AsCas12a) e ha dimostrato che AcrVA5 era in grado di inattivare entrambi gli ortologhi (Figg. Supplementari S2 e S3). Notevolmente, AcrVA5 si è mai dimostrato inefficace contro AsCas12a in uno studio precedente6, tuttavia, abbiamo scoperto che AsCas12a conteneva il residuo di lisina conservato (Figura complementare S3c) e ha dimostrato che il trattamento mediato da AcrVA5 ha portato alla perdita sia di cis- che di attività di trans-scissione di AsCas12a con dsDNA target.

L'acetilazione post-traduzionale della lisina svolge un ruolo importante in diversi processi cellulari negli organismi, dai batteri all'uomo9. Nei batteri, il CobB di tipo sirtuina NAD+-dipendente deacetila un gran numero di proteine ​​e regola il livello di acetilazione globale7. Per verificare se CobB può deacetilare il Cas12a trattato con AcrVA5 e riattivare le sue attività di cis e trans-scissione, abbiamo quindi purificato CobB e LbCas12a di E. coli ricombinanti ed eseguito il test di deacetilazione in vitro. Sulla base dei risultati del western blot, Cas12a è stato acetilato con successo da AcrVA5 in presenza di acetil-CoA e la modificazione dell'acetile potrebbe essere rimossa in modo efficiente dopo essere stata trattata con CobB. Coerentemente con i risultati precedenti7, la deacetilazione mediata da CobB richiede rigorosamente NAD+ come cofattore (Figura complementare S4). Di conseguenza, LbCas12a acetilato con AcrVA5 ha perso sia le attività di scissione cis che trans con il dsDNA target, ma ha recuperato entrambe le attività in larga misura dopo essere stato deacetilato da CobB (Fig. 1a, b). Inoltre, abbiamo testato diversi ortologi Cas12a come FnCas12a e AsCas12a e abbiamo scoperto che CobB era in grado di deacetilare e riattivare entrambi gli ortologi Cas12a (Figg. supplementari S5-S8). Vale la pena ricordare che la riattivazione riuscita dell'AsCas12a acetilato mediante trattamento con CobB ha dimostrato ancora una volta che AsCas12a è un bersaglio di AcrVA5 (Figura complementare S3), mentre la ragione dei risultati distinti tra questo lavoro e lo studio precedente6 era ancora sconosciuta e potrebbe essere una domanda interessante soggetta a ulteriori indagini. Sulla base dei risultati di cui sopra, si può concludere che AcrVA5 e CobB regolano in modo reversibile sia le attività di scissione cis che trans di Cas12a modulando il suo stato acetilico in vitro.